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iFluor™ 647琥珀酰亚胺酯

简介

iFluor 染料是一系列优秀的荧光标记染料,可以覆盖整个可见光谱。所有iFluor 染料都具有优异的水溶性。它们的亲水性使有机溶剂的使用最小化。 iFluor 染料也具有比经典荧光标记染料更好的标记性能,如FITC,TRITC,Texas Red ,Cy3 ,Cy5和Cy7 。一些iFluor 染料在某些抗体上明显优于Alexa Fluor 标记染料。它们是用于标记蛋白质和核酸而不包含性能的最便宜的荧光染料(替代Alexa Fluor 染料)。每种iFluor染料的开发都与特定的Alexa Fluor 或其他标记染料(如DyLight 染料)的光谱特性相匹配。

琥珀酰亚胺基(NHS)酯被证明是用于胺修饰的最佳试剂,因为形成的酰胺键基本上与天然肽键相同并且稳定。这些试剂通常是稳定的并且与脂族胺显示出良好的反应性和选择性。当琥珀酰亚胺酯化合物用于缀合反应时,需要考虑的因素很少:1)。溶剂:在大多数情况下,活性染料应溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中。 2)。反应pH:胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应强烈依赖于pH。胺反应性试剂与非质子化脂族胺基团反应,包括蛋白质的末端胺和赖氨酸的β-氨基。因此,胺酰化反应通常在pH 7.5以上进行。通过琥珀酰亚胺酯进行的蛋白质修饰通常可以在pH 8.5-9.5下进行。 3)。反应缓冲液:使用胺反应试剂时,必须避免使用含有游离胺(如Tris和甘氨酸)和硫醇化合物的缓冲液。广泛用于蛋白质沉淀的铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)也必须在进行染料缀合之前除去(例如通过透析)。 4)。反应温度:大多数缀合在室温下进行。然而,特定标记反应可能需要升高或降低的温度。

存储和处理

收到后,iFluor™染料应储存在,并避免光照和潮湿。 iFluor™染料的重构DMSO储备溶液可以在℃下储存不到两周。 蛋白质缀合物应在载体蛋白(例如0.1%牛血清白蛋白)存在下以> 0.5mg / mL储存。 当在2mM叠氮化钠存在下保存并且避光时,缀合物溶液可以在4℃下储存两个月而没有显着变化。 对于更长时间的储存,可以将蛋白质缀合物冻干或分成单次使用的等分试样并在≤-60℃下储存,并避光。

染色样本分析

注意:该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™647 SE的缀合物开发的。 您可能需要进一步优化您的特定蛋白质。

操作步骤

1.准备蛋白质储备溶液(溶液A):

将100μL反应缓冲液(如1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液,pH~9.0)与900μL目标蛋白溶液(如抗体,蛋白质浓度> 2 mg / ml,如果可能)混合至100μL给予1 mL蛋白质标记原液。

注1:蛋白质溶液(溶液A)的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0,则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH调节至8.0-9.0的范围。

注2:蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中,则必须用pH7.2-7.4的1X PBS透析,以除去广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐(例如硫酸铵和乙酸铵)。

注3:用牛血清白蛋白(BSA)或明胶稳定的不纯抗体或抗体不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳*的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳*,以获得最佳标记结果。

注4:如果蛋白质浓度低于2 mg / mL,则结合效率会显着降低。为获得最佳标记效率,建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。

2.准备染料储备溶液(溶液B):

将无水DMSO加入到iFluor TM染料SE小瓶中以制备10-20mM储备溶液。 通过移液或涡旋混合均匀。

注意:在开始缀合前准备染料储备溶液(溶液B)。 及时使用。 染料储备溶液的长期储存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存两周,避光保存。 避免冻融循环。

3.确定最佳染料/蛋白质比例(可选):

注意:每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例,这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能不利地影响其结合亲和力,而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您通过使用连续不同量的标记染料溶液重复步骤4和5来实验确定最佳染料/蛋白质比率。通常,对于大多数染料 - 蛋白质缀合物,推荐使用4-6种染料/蛋白质。

3.1使用10:1摩尔比的溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)作为起始点:将5μl染料储备溶液(溶液B,假设染料储备溶液为10 mM)加入到样品瓶中。蛋白质溶液(95μl溶液A)有效摇动。假设蛋白质浓度为10mg / mL并且蛋白质的分子量为~200KD,蛋白质的浓度为~0.05mM。

注意:蛋白质溶液中DMSO的浓度应%。

3.2运行缀合反应(参见下面的步骤4)。

3.3重复#3.2,溶液B /溶液A的摩尔比为5:1;分别为15:1和20:1。

3.4使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。

3.5计算上述4种结合物的染料/蛋白质比(DOS)(见下页)。

3.6运行上述4种结合物的功能测试,确定最佳的染料/蛋白质比例,以扩大标记反应。

4.运行结合反应:

4.1有效加入适量的染料储备溶液(溶液B)到蛋白质溶液(溶液A)的小瓶中晃动。

注意:溶液B /溶液的最佳摩尔比由步骤3.6确定。如果跳过步骤3,我们建议使用10:1溶液B(染料)/溶液A(蛋白质)的摩尔比。

4.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

5.纯化缀合物

以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料 - 蛋白质缀合物的实例。

5.1按照制造说明准备Sephadex G-25色谱柱。

5.2将反应混合物(直接从步骤4)加载到Sephadex G-25柱的顶部。

5.3样品在顶部树脂表面下方运行时立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

5.4向所需样品中加入更多PBS(pH 7.2-7.4)以完成色谱柱纯化。 合并含有所需染料 - 蛋白质缀合物的级分。

注1:立即使用时,染料 - 蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释,并等分多次使用。

注2:对于长期储存,染料 - 蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥(见下文)。

表征所需的染料 - 蛋白质缀合物

取代度(DOS)是表征染料标记蛋白质的最重要因素。 较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度,但较高DOS(例如DOS> 6)的蛋白质也倾向于具有减少的荧光。 根据染料和蛋白质的特性,大多数抗体的最佳DOS建议在2到10之间。 为了有效标记,应将取代度控制为对于1摩尔抗体具有4-10摩尔的iFluor TM 647 SE。 以下步骤用于确定iFluor TM 647 SE标记蛋白的DOS。

1.测量吸收:

为了测量染料 - 蛋白质缀合物的吸收光谱,建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在1-10μM的范围内。

2. 读取280 nm处的OD(吸光度)和染料最大吸收(iFluor™647染料的ƛmax= 649 nm):对于大多数分光光度计,样品(来自色谱柱部分)需要用去离子水稀释,以便OD 值在0.1至0.9的范围内。 O.D. (280nm处的吸光度)是蛋白质的最大吸收,而649nm是iFluor TM 647 SE的最大吸收。 为了获得准确的DOS,确保缀合物不含非共轭染料。

3. 使用以下等式计算DOS:

[染料]是染料浓度,并且可以根据Bee-Lambert定律容易地计算:A =εdyeCL。 [蛋白质]是蛋白质浓度。 如果共轭效率足够高(优选> 70%)或通过比尔 - 朗伯定律更准确地计算,则该值可以通过重量(加入反应)估算:A =ε蛋白质CL。 例如,IgG的ε值为203,000cm-1M-1。 Pε280= 280nm处的蛋白质摩尔消光系数(例如IgG的摩尔消光系数为203,000cm-1M-1)。 对于iFluor TM 647染料SE,CF(280nm处的染料吸收校正因子)= OD280 / OD649 = 0.03。 250,000 cm-1M-1是iFluor™647 SE的摩尔消光系数。

参考文献

1. Hermanson GT (1996). Biocojugate Techniques, Academic Press, New York.

2. Haugland RP (1995). Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Methods Mol Biol 45, 205-21.

3. Brinkley M (1992). A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking

reagents. Bioconjug Chem 3, 2-13.



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