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如何正确地建立实验室细胞库?

研究人员在进行细胞实验时,哪些原因会导致科研数据的波动与差错?1. 细胞微生物污染(如:支原体,细菌,真菌,病毒等)
2. 细胞交叉污染
3. 细胞基因突变
4. 细胞衰老
5. 人为操作失误

平时,研究人员细胞的来源有三种,一种是直接从商业化公司(如ATCCDSMZ中科院细胞所)购买,另一种为自己从原代组织分离,还有一种是从其他实验室或科研人员处获取。

既然如此方便,我们为什么要自己建立细胞库呢?有何意义?
细胞库可以有效保持贮存细胞的生物学效用和功能,为科研实验提供检定合格、质量稳定、可持续获得的细胞。

1. 节省实验室空间、时间、经费
2. 若实验失败,还有重来的机会
3. 确保实验重复的一致性
4. 确保未来实验的连贯性
因此实验室有必要建立一个安全、规范、稳定、可追溯的细胞库,我们需要从源头保证整个研究实验的规范性。

目前,世界上较权威的细胞库机构或者研究院都采用三级细胞库管理模式,即:原始细胞库(PCB,Primary Cell Bank),主细胞库(MCB,Master Cell Bank),工作细胞库(WCB,Working Cell Bank)。

1. 原始细胞库(PCB,Primary Cell Bank)

原始细胞库(PCB,Primary Cell Bank),又名细胞种子(Cell Seed)或初级细胞库(Pre-master Cell Bank),由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体,或者经过克隆培养形成的均一细胞群体,经检定证明合格。将一定数量、成分均一的细胞悬液定量装于细胞冻存管,与液氮或-130℃以下冻存,即为原始细胞库,供建立主细胞库使用。

2. 主细胞库(MCB,Master Cell Bank)

主细胞库(MCB,Master Cell Bank)指的是,原始细胞库细胞传代增殖后均匀混合成一批,定量分装,保存于液氮或-130℃以下。这些细胞经检定合格后,即为主细胞库,供建立工作细胞库使用。

3. 工作细胞库(WCB,Working Cell Bank)

工作细胞库(WCB,Working Cell Bank)是经过主细胞库传代增殖,达到一定代次水平的细胞,混合后制成一批均质细胞悬液,定量分装于一定数量的细胞冻存管,保存于液氮或-130℃以下备用。这些细胞经检定证明合格后,即为工作细胞库。

不同的细胞系传代能力不同,因此,研究人员须根据自己的细胞系确定工作细胞的传代次数。

▲ 细胞库建立流程图


细胞库的检定

上面我们介绍过在进行各级细胞库的建立时,都要进行检定,合格后才可成为相应细胞库。细胞检定主要包括以下几个方面:细胞鉴别,细菌、真菌检查,支原体检查,细胞内外源病毒因子检查,致瘤性检查,必要时还须进行细胞染色体、细胞生长特性、细胞均一度及稳定性检查。

▽ 细胞检定项目

在建立这些细胞库的过程,冻存这个操作步骤是非常重要的,必须要遵守“慢冻”原理,具体操作步骤可以点击此处查看“细胞冻存的那些事儿”

当建立好各级细胞库后,重要的是要如何进行管理?
细胞库的管理

研究人员应检测并维护细胞库冻存器,以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。每种细胞库均应分别建立台账,详细记录放置位置 ,容器编号,分装及冻存数量,取用记录等。细胞库中的每支细胞冻存管均应具有细胞系/株名、代次、编号、冻存日期、贮存容器编号等信息。

细胞系记录表



为保证细胞冻存后仍具有良好的活力,每建立一级细胞库,冻存前的细胞活力应不低于90%,冻存后应取一定量的(可代表冻存全过程)冻存管,复苏细胞进行检测,复苏后细胞的活力应不低于80%。一般细胞冻存2-3天温度趋于稳定后,即可进行细胞活力检测。

细胞复苏记录表




那么我们在建立细胞库的时候,应该如何确定冻存数量和冻存密度呢?

原始细胞库、主细胞库和工作细胞库冻存多少数量,可根据自己的需要确定,只要满足后续科研实验需求即可,即遵循“够用原则”。一般经验来说,冻存的细胞密度为1-10×106 cells/ml,冻存体积1-1.5 ml/管。

一些细胞冷冻保存细胞密度 :

1. Normal human fibroblast(人成纤维细胞):1-3×106 cells/ml。
2. Hybridoma(杂交瘤细胞):1-3×106 cells/ml。
3. Adherent tumor lines(贴壁肿瘤细胞系):5-7×106 cells/ml,依细胞种类而异。Adenocarcinoma(腺癌细胞)解冻后须较高之密度,而HeLa只需要1-3×106 cells/ml。
4. Other suspensions(悬浮细胞):5-10×106 cells/ml。
5. Human lymphocyte(人淋巴细胞):至少5×106 cells/ml。

参考资料

1. 国家药典委员会.中华人民共和国药典:中国医药科技出版社,2015

细胞库的建立方法介绍就到这里啦
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