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突破!稻瘟病菌致病“元凶”现形?浙大林福呈教授团队揭示鞘脂是关键因子

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稻瘟病是由稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae) 引起的毁灭性病害,有“水稻癌症”之称。稻瘟病世界各地均有发生,严重威胁全球水稻产量和粮食安全。稻瘟病菌入侵宿主的方式比较独特,是通过形成特殊的侵染结构—附着胞(appressorium)的方式入侵植物,然而附着胞侵染叶片的生理过程尤其是哪些关键分子参与或者调控侵染致病机制仍然没有完全清楚。

浙江大学林福呈教授团队在《mBio》(IF=6.747)杂志上发表名为“Metabolomics Analysis Identifies Sphingolipids as Key Signaling Moieties in Appressorium Morphogenesis and Function in Magnaporthe oryzae”的研究论文,作者利用非靶向代谢组学确定鞘脂是稻瘟病菌附着体发育和侵染致病的关键分子。

研究材料与组学技术

实验材料:7个不同发育时期的水稻稻瘟病菌附着体

组学技术方法:非靶向代谢组(GC-MS和LC-MS/MS)

技术路线图

研究小结

1、非靶向代谢组学筛选关键代谢物

首先,作者对7个不同发育时间点附着胞的代谢物进行非靶向代谢组学技术分析(GC-MS和LC-MS/MS),分别鉴定到110个(GC-MS)和29个(LC-MS/MS)代谢物,发现这7个时间点分组独立分开,组间差异较大,反映附着胞不同发育时间代谢轮廓有明显差异。接着,作者重点比较0小时未出芽的孢子和24小时成熟附着胞(具有侵染致病能力)的差异代谢物,KEGG富集分析表明包括早期鞘脂合成在内的六个关键代谢通路发生显著变化。其中鞘氨醇,植物鞘氨醇,二羟神经酰胺和神经酰胺在附着胞成熟过程中变化显著,暗示鞘脂在附着胞成熟和致病过程中可能发挥重要作用。

2、功能验证1-化学抑制剂

因为对鞘脂这种脂类信号在真菌中的作用知之甚少,为了进一步研究稻瘟病菌中鞘脂合成途径早期中间产物的作用,作者分别利用多球壳菌素(myriocin,Myr)抑制丝氨酸棕榈酰转移酶(鞘氨醇生物合同途径关键酶),以及利用伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)抑制鞘氨醇-N-酰基转移酶(神经酰胺合成酶复合体重要亚基),发现Myr和FB1处理导致附着胞发育紊乱和形态异常,尤其是入侵栓的形成严重受阻,进而导致稻瘟病菌侵染水稻和大麦的致病力严重下降,而且此效果呈现Myr和FB1的剂量依赖效应,且Myr和FB1都属于神经酰胺合成抑制剂。以上结果表明早期鞘脂代谢产物神经酰胺合成抑制剂影响附着胞的形态建成和致病力。

3、功能验证2-遗传学(基因敲除/互补)

接下来为了进一步证实神经酰胺在稻瘟病致病性中的作用,作者对编码稻瘟菌中合成神经酰胺发挥重要作用的酶的基因进行敲除,获得了ΔMolag1突变体,稻瘟病菌LAG1编码鞘氨醇-N-酰基转移酶,在酰基辅酶A和植物鞘氨醇合成神经酰胺中起作用。相比于正常稻瘟病菌株Guy11,ΔMolag1突变体表现出菌丝发育受阻,以及分生孢子形成和无性繁殖明显缺失,同时侵染实验发现对水稻和大麦的致病力几乎完全丧失。基因互补后,ΔMolag1/ Molag1生长发育和致病能力完全恢复。同时作者在ΔMolag1基础上添加神经酰胺,发现ΔMolag1+神经酰胺同样能恢复其侵染致病能力。综上所述,Molag1或者神经酰胺生物合成对稻瘟病菌发育和致病具有不可或缺的重要作用。

4、机制探索:神经酰胺影响稻瘟病菌发育和致病的机制

作者比较了不同发育时间点分生孢子和附着胞的细胞核数量发现,Myr抑制神经酰胺合成,导致细胞周期异常,尤其是分裂晚期中细胞核的降解异常。神经酰胺合成抑制剂导致附着胞形态发生变化,该过程涉及三个主要的信号级联通路:cAMP-PKA、TOR和蛋白激酶C介导的细胞壁完整性(PKC-CWI)途径。因此作者探讨了神经酰胺和这三种信号通路的关系。结果发现ΔMolag1突变体中PKC-CWI通路中的Mps1磷酸化水平显著被抑制,遗传互补或者补充神经酰胺后其磷酸化水平恢复,暗示神经酰胺通过PKC-CWI途径和细胞周期来调控稻瘟病菌的生长发育和侵染致病功能。

5、最终结论:葡糖神经酰胺是稻瘟病菌发育和致病的决定物质

众所周知,神经酰胺还可以被转化为葡糖神经酰胺(GlcCer)和磷酸肌醇神经酰胺(IPC)---鞘脂生物合成的最终产物。那么,稻瘟病菌生长发育受阻以及侵染致病能力缺失到底是哪种物质在起作用呢?作者利用神经酰胺半乳糖基转移酶突变体ΔMocgt1进行研究,发现ΔMocgt1中生长发育受阻和侵染能力严重下降(基因互补后)。而同时使用金担子素抑制IPC合成时发现并不影响稻瘟病菌形态建成和侵染致病能力,以上结果表明葡糖神经酰胺作为鞘脂生物合成的最终产物,对稻瘟病形态建成和致病过程有十分重要的作用。

小编总结

作者利用非靶向代谢组学分析了稻瘟病菌不同发育时间点附着胞内的代谢物质,筛选差异代谢物并确定神经酰胺是附着胞正常发育和致病所必需的代谢物质。此功能是神经酰胺通过调控附着胞发育的细胞周期(有丝分裂)过程和附着胞极性生长的PKC-CWI信号途径的Mps1磷酸化水平来实现。最终通过遗传分析手段证明了葡糖基神经酰胺对于稻瘟病菌致病过程的重要性。研究结果为分析与侵染相关的信号网络中的化学成分提供新视角,为开发针对水稻和其他谷类病害的新型药物提供了潜在的靶标。

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