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中检院CAR-T细胞治疗产品质控文件《考虑要点》深度解析
2018年6月5日,中国食品药品检定研究院发布了《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》(以下简称《考虑要点》)。相信这一文件对所有CAR-T细胞治疗的从业者都具有重要的指导意义。
考虑要点》对CAR-T细胞研发和制备的以下几个方面进行了深入的探讨:
-原材料和辅料及其质量控
-病毒转导载体及质粒转染载体制备及质量控
-建立可提供T细胞的供体资质标
-CAR-T细胞产品的生产、质量控制研究及检测

在“CAR-T细胞产品的生产、质量控制研究及检测”这一章节中,细胞数量及细胞存活率被列为CAR-T细胞产品质量控制的两项重要的检测指标:

细胞数量及细胞存活率:对于CAR-T细胞来说,患者输入的细胞数及活率不仅与临床有效性及临床副反应密切相关,而且是设置CAR-T细胞产品包装规格及临床剂量的重要参数,因此,需要建立准确的细胞计数及活率检测方法,并建立产品的放行标准

目前有多种方法用于CAR-T细胞治疗产品的细胞计数,包括传统血球计数板计数法及细胞自动计数仪计数法,其中自动计数仪又包括不同的计数原理,如利用台盼蓝染色计数、荧光染色法计数及非染色法计数等。与人工计数法相比,自动计数仪节省人工,且明显减少不同操作者之间的误差,对于产品质控检测来说,自动计数仪检测结果的可重复性更好。"

我们看到经过细胞计数仪开发者多年的市场推广和用户自身经验的积累和传播,自动细胞计数仪相对于人工计数法的优势已被细胞研究者们广泛接受以及得到了权威机构的认可。

《考虑要点》同时提到:不同自动计数仪因每种方法计数原理不同,同一样本在不同的计数仪上的结果会有明显的差异,这些差异可能来自于染料的特性及其标记特性、区分细胞不同活力状态(如活细胞、死亡、凋亡细胞)的能力及计数软件的设计等,因此,应在计数方法验证的基础上建立细胞数及活率标准,且细胞数应设立上限及下限标准,细胞使用前活率应不低于70%...” 由此可见,在CAR-T细胞的生产和质控流程中,对细胞计数仪的选择也是相当重要的。目前各品牌细胞计数仪的计数原理主要分为两种:台盼蓝染色计数和荧光染色计数。众所周知,在CAR-T细胞制备的前期需要从外周血单核细胞(PBMC)中分选出T细胞,因此PBMC的数量和存活率对于CAR-T的生产至关重要。现在小编就以分析PBMC为例介绍一下台盼蓝染色和以AO/PI(吖啶橙/碘化丙叮)为代表的荧光核酸染色的差异【1】:
以上列出的差异都是从大量实际操作中总结出来的。用台盼蓝数PBMC, 细胞总数往往会高于实际白细胞数,有时甚至可以达到10倍以上【2】!另外,由于台盼蓝容易低估死细胞数,用这种方法测出的存活率也会比实际值高,在某些情况下甚至会高出30%以上!如果我们用这样的检测结果去进行CAR-T细胞的制备,其后果可想而知。

荧光核酸染色是目前公认的最可靠的细胞计数方法之

十多年前,斯坦福大学的Leonore A. Herzenberg实验室用AOEB的混合液对细胞染色,然后在荧光显微镜下计数,发现了该方法相对于台盼蓝法的优越之处,尤其是数混杂的细胞样本比如PBMC。 之后,美国Nexcelom公司在此基础之上于2008年开发出了AO/PI混合染料,并将荧光计数功能添加到了Cellometer细胞计数仪,使很多实验室能够轻松地用这种更精确的方法分析细胞。2013年,Cellometer的用户之一国立卫生研究院疫苗研究中心的Roederer实验室将双荧光染色法分析T细胞的方法发表在了Nature Protocols3上,使得这一方法为更多科学家所知。

如今,AO/PI染色法和Cellometer荧光细胞计数仪正在被越来越多的研究机构和企业用于CAR-T细胞的研发、生产和质控。我们的用户包括了世界最顶尖的制药公司、大学、研究所和生物技术企业。我们相信,国家对CAR-T细胞治疗产品质量的控制和管理会越来越规范和严格,这也意味着在CAR-T细胞开发的每一个环节我们都需要有工匠精神,精益求精。Nexcelom会一如既往地致力于细胞分析方法的创新和开发,为推进中国的细胞治疗产业化贡献应有的力量

文献索引
1. Chan L L, Kuksin D, Laverty D J, et al. Morphological observation and analysis using automated image cytometry for the comparison of trypan blue and fluorescence-based viability detection method.[J]. Cytotechnology, 2015, 67(3):461-73.
2. Chan L L, Laverty D J, Smith T, et al. Accurate measurement of peripheral blood mononuclear cell concentration using image cytometry to eliminate RBC-induced counting error[J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 388(1-2):25-32.
3. Lugli E, Gattinoni L, Roberto A, et al. Identification, isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells.[J]. Nature Protocols, 2013, 8(1):33-42. 索取资料
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